Cada dia mais a citometria de fluxo é utilizada dentro dos protocolos de pesquisa, e montar o painel ideal já não é tão simples como antes. Corantes bem conhecidos como APC, FITC e PE são agora complementados por fluoróforos mais novos e mais brilhantes, com faixa de excitação mais estreita e perfis de emissão e assinaturas espectrais exclusivas.
Além disso, pode-se selecionar fluoróforos que permitem o ajuste do brilho com base nos requisitos do painel. Embora a lista de fluoróforos disponíveis continue a crescer, é essencial considerar as principais características do fluoróforo durante a elaboração do painel.
Mas então, como montar um painel ideal?
Para isso temos algumas dicas de extrema importância que devem ser consideradas:
1) Independentemente dos fluoróforos serem antigos ou novos, deve-se fazer as mesmas considerações para o design do painel. Isso inclui a combinação de fluoróforos mais brilhantes com antígenos de baixa quantidade e a combinação de corantes com sobreposição espectral mínima para minimizar o transbordamento para os canais próximos, utilizando o processo de compensação apenas se necessário.
2) Uma característica importante do fluoróforo, mas frequentemente esquecida, é o spread (espalhamento). O spread reduz a resolução dos resultados da citometria de fluxo, o que pode levar à perda de dados e conclusões imprecisas.
3) Outro fator a ser considerado durante a montagem do painel é a estabilidade do fluoróforo. Os corantes em tandem podem degradar devido à fotossensibilidade ou armazenamento a longo prazo.
4) E uma última consideração é que os fluoróforos podem se ligar inespecificamente a certos tipos de células como, por exemplo, a ligação do corante Cy a monócitos e macrófago. Para evitarmos essas ligações podemos utilizar os buffers de bloqueio (p ex. Human TruStain FcX™).
A maioria dos painéis de citometria de fluxo convencionais contém normalmente entre 4 a 20 cores, com menos de 10 cores geralmente sendo a norma. Instrumentos de última geração (como o citômetro spectral) e a disponibilidade de fluoróforos com novas propriedades espectrais permitem análises bem-sucedidas de até cerca de 40 cores em uma mesma amostra. Além do mais, o uso desses novos fluoróforos no painel de citometria pode ser vantajoso quando comparado ao uso dos convencionais, já que o sistema mais antigo dos citometros tem detectores menos sensíveis do que os modelos mais recentes.
Por fim, o desenvolvimento de novos fluoróforos permitem o aumento do escopo da análise multiparamétrica.
Os nossos corantes Fire ™, por exemplo, são fluoróforos em tandem projetados para preencher espaços espectrais anteriormente não utilizados na citometria de fluxo convencional. Alguns deles foram desenvolvidos especificamente para aplicações de citometria espectral, como APC / Fire ™ 810, que é ideal para os citômetros espectrais mais recentes que têm detecção aprimorada na faixa de 800 nm. O novo PE / Fire ™ 640 é outra adição útil aos painéis de citometria espectral, que pode ser combinado com fluoróforos amplamente adotados como PE / Dazzle ™ 594 e PE / Cyanine5.
É importante estarmos sempre atentos as atualizações em citometria, pois elas estão abrindo caminhos para que pesquisadores adotem fluxos de parâmetros mais elevados e identifiquem populações de células únicas para responder a questões científicas mais complicadas.
