Para a hibridização fluorescente in situ (FISH), é necessário um microscópio de fluorescência. A configuração deste é composta por uma fonte de luz que emite luz de alta intensidade com um amplo espectro. Esta luz é filtrada por um filtro de excitação que transmite apenas um certo comprimento de onda e é desviado por um espelho dicróico (divisor de feixe). A luz desviada é focalizada na amostra pela lente objetiva. Os fluorocromos são excitados e emitem luz com um comprimento de onda maior que o da luz de excitação. A luz de fluorescência emitida da amostra retorna pela objetiva e passa pelo espelho dicróico devido ao maior comprimento de onda. Essa luz é filtrada pelo filtro de emissão que define o comprimento de onda da luz que atinge a ocular e que é visualizada.
• Os fluorocromos é um grupo funcional da molécula que absorve luz (energia) de um comprimento de onda específico e posteriormente a emite num comprimento de onda superior (ou seja, com menor energia). Esta luz de excitação é produzida por certas fontes de luz como a recomendada lâmpada de excitação de mercúrio de 120 watts. A fonte de luz tem uma vida útil de aproximadamente 2000 horas e deve ser trocado regularmente. Caso contrário, a intensidade do sinal pode diminuir.
• Para microscopia de fluorescência, é essencial o uso de um óleo de imersão especialmente indicado para fluorescência para evitar a autofluorescência. Além disso, lâminas e lamínulas de vidro também devem ser adequadas para microscopia de fluorescência.
• De especial importância é a escolha dos conjuntos de filtros. Os conjuntos de filtros devem ser compatíveis com os máximos de excitação e emissão do fluorocromo aplicado. Os fluorocromos a seguir são usados no ZytoVision FISH.
Dois fatores são essenciais para a avaliação por FISH:
O fluorocromo das sondas FISH.
A utilização do filtro correto.
